前作のアルタイルの時代（第3次十字軍の時代）から約290年後。

時はルネッサンス期のイタリア。

銀行家の次男坊であった、エツィオ・アルヴァトーレがテンプル騎士団の陰謀により父・兄・弟を処刑されるところから物語は開始されます。

父を裏切った友人であったはずの判事に復讐した後、残された母と妹を守りながら叔父の元を訪ね、そこで父がアサシンであったことを知らされます。

 叔父の指導を受け、アサシンの技を身につけ、父の敵であるテンプル騎士団を暗殺していくことになります。

その過程で、アルタイルが残した遺産などを回収していくことで、エデンの果実に絡む謎にも迫っていくことに。

その他、歴史上、実在の人物たちが幾人もエツィオの協力者となってくれます。

レオナルド・ダ・ビンチやマキャベリなどなど。

4から始めた私には1の操作性の悪さがあれだったんですが･･･

本作より空中から飛びかかって暗殺するエアアサシンが可能になりました。

また、かなり後半になりますが、アサシンブレードに仕込まれたピストルを使用することも可能です。

※投げナイフならもっと序盤の方から使えます。

戦闘ではないですが、壁登りなどでかなりのアクション性を求められる場所もあるので、アクション苦手な人には大変かも。

※アクション苦手な人がこのゲームやるとも思えないですけどねｗ

また水の都といわれるヴェネチア（ベニス）では、現実と同じように水路が街の中を縦横無尽に走り、ゴンドラを使って移動することも可能です。

1では水におちるとシンクロ解除でしたが、本作では泳ぐことも潜ることも可能です。